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2019-07-04

eGenesis等5家初创公司CEO解说CRISPR技术最新动向

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▲eGenesis正使用基因编辑技术推进异种移植 - 即在不同物种之间的器官,组织或细胞的移植。例如,为了帮助猪组织安全移植到人体内,该公司消除了猪内源性逆转录病毒(PERVs),并添加了增强人体相容性的元素。


CRISPR正在彻底颠覆科学基础研究,而在工业方面,影响却略显不足。

就商业应用而言,CRISPR基因编辑方法仍然过于粗糙和缺乏灵活性,可能适用于修补程序,但缺乏商业应用所需的复杂性,特别是对于临床应用。CRISPR仍然受到潜在的不确定性和技术缺陷(包括递送限制、脱靶效应和可扩展性差)的限制。

为了帮助CRISPR实现其商业价值,世界各地的公司正忙着为CRISPR工具箱添加工具,这些工具提供易用性、功能性、复杂性以及经济性。其中许多公司都是新成立的创业公司,他们通过创新来弥补所缺乏的经验。

为了捕捉最新动向,GEN(Genetic Engineering&Biotechnology News)与几家致力于升级CRISPR的初创公司CEO进行了交谈。本文将这些CEO关注的领域方向及主要观点整理出来,供各位读者思考。

1、高通量基因组工程

Inscripta首席执行官Kevin Ness博士表示,除非开发更好的CRISPR工具,否则CRISPR基因编辑将难以建立商业应用。

Ness称,该公司正在开发一种高通量、多重基因组编辑平台,该平台允许科学家在一次实验中进行数万次插入、删除和交换,这被称为“世界上第一个可伸缩的台式数字基因组工程平台”。

“传统的CRISPR / Cas9方法每执行一次编辑,都需要查询基因组的一个区域,这是一种非常有限,费力的查询基因组或创建特定细胞的方法。”

Inscripta的基因组工程技术旨在为用户提供全自动的系统,它将在今年晚些时候推出。

“该平台基于一种新化学,”Ness解释道:“切割基因组的指导序列和修复切割的同源臂共价连接在一起,为基因组工程创建了一个大而精确的细胞库。这种方法还对每个细胞的变化进行了条形编码。由于指导序列和同源臂同时递送,科学家们可以在可扩展范围内精确定位许多位点。该平台结合了Inscripta的专利酶系统(MADzymes),专有化学,基于微流体的仪器,以及新颖的软件和算法。

一直以来,CRISPR的应用受到知识产权和与效率,可扩展性和成本相关的限制。为了帮助用户解决使用障碍,Inscripta开始向学术界和商业研发中的用户免费提供MAD7酶。

Ness指出:超过1000人在第一年下载了序列,并且从反馈来看,用MAD7进行的单次实验产生的结果与用Cpf1(Cas9的替代品)获得的结果相当,计划在2019年下半年实现额外的MADzymes商业化。

“它们可以互换用于切割和修复基因组,”Ness断言。MADzymes加上Inscripta即将推出的高通量基因组工程技术,“将允许研究人员使用迭代方法设计特定的细胞表型,从而开发出最多样化和最精确的文库。”

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今年2月,Inscripta公司在C系列融资募得5550万美元,用于加速其基因编辑配套工具的开发和商业化。6月,Inscripta被《麻省理工科技评论》列入2019年50家聪明公司榜单。7月,公司基于其首个游离CRISPR酶MAD7的基因编辑系统获得美国专利,利用另一种MADzyme MAD2的基因编辑系统也获得了美国专利。

2、靶向基因传递

Ligandal创始人、董事长兼CEO安德烈•沃森表示:“CRISPR和基因编辑工具非常强大。但你仍然需要编辑到正确的细胞中。否则,基因编辑就不会过渡到基因治疗。”

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▲配体基因/蛋白传递纳米技术示意图。纳米颗粒是肽基的具有多个生物活性阶段。

在递送的过程中,脆弱的核酸—或者某些情况下的Cas9蛋白、免疫原蛋白—需要避开免疫系统,直到它们到达靶细胞。Ligandal使用配体构建成纳米颗粒来运送遗传物质,通过细胞内吞纳米颗粒向靶细胞(包括T细胞和造血干细胞)提供精确的遗传指令。

这项技术是从沃森本科时在生物工程和纳米材料方面的工作发展而来的,目的是递送经过编辑的重组基因。在这项工作中,他开发了一种将转录激活剂如效应核酸酶用包装材料进行涂层的方法:内层静电肽,中间层可降解二氧化硅,最后外层是细胞穿透或细胞靶向肽。最终,核酸酶位于分层纳米颗粒的核心。

随后的改进使包含crispr编辑结构、信使RNA、短干扰RNA、DNA和其他遗传或蛋白质成分的配体能够基于靶细胞表面的特定受体进行传递。靶向机制可以针对特定的细胞类型、组织或器官进行微调,从而最小化副作用。

“如果我们能够识别细胞表面蛋白的独特性,我们就可以开发一个计算模型来模拟配体与细胞表面受体的识别过程,”沃森断言。然后配体就可以追踪正在传递的靶向分子和(或)基因,它可以设计一个传递系统来靶向细胞核,传递系统可以为速释或缓释两种类型。

沃森称:“我们为了确定最有效的递送系统,尝试了数千种个不同的方案。”

该系统的第一部分依赖于一个机器人平台,在大约一个小时内合成肽。沃森解释说:“它具有预测性,所以我们不需要筛选1021个序列来确定最佳候选序列。”“人体不喜欢随机序列,所以我们根据人体已经熟悉的天然蛋白质构建肽。”

该过程的第二部分使用水相静电方法创建纳米颗粒。他指出这种方法不需要净化,“配体围绕我们想要传递的特定有效载荷自组装,因此我们可以使用流体处理机器人来开发和筛选多肽纳米颗粒的大小、电荷和下游生物特性。细胞分析可以识别基因序列、细胞存活、有效载荷等。”

由于配体材料来源于天然蛋白质,并对细胞和亚细胞特异性进行了规划,因此随着后续筛选的进行,纳米材料逐渐进化。目标是为特定的细胞类型、有效载荷和治疗应用预测制造优化的纳米颗粒。

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在临床前研究中,Ligandal的技术已经成功地瞄准了血液和骨髓中的特定细胞,而且它似乎在基因治疗中能广泛应用。公司正在与免疫学和血液学领域的潜在合作伙伴进行讨论,并有望在今年夏天发布合作声明。“明年,我们将有重大消息,”CEO沃森预测。

3、iTOP技术

Ntrans Technologies首席执行官Marco de Boer博士指出,对于CRISPR/Cas9基因编辑复合体来说,递送也是一个特殊的挑战。他的公司开发了一种名为iTOP的无病毒细胞靶向方法,利用小分子诱导治疗蛋白进入靶细胞,可用于体内或体外应用。

“itop介导的传递是基于自然细胞摄取过程,”de Boer解释说。iTOP以核糖核蛋白(RNP)复合物的形式传递CRISPR/Cas9复合物,该复合物迫使靶细胞大量吸收细胞外液。每一口都会产生一个含有生物活性分子的细胞内囊泡。最终,小泡释放它们的有效载荷进入细胞质,产生治疗效果。

de Boer指出“这有两个重要的好处,CRISPR/Cas9复合物立即活跃起来,有效地引入了所需的修改。由于复合物在相对较短的时间内被分解,降低了目标外效应的风险。此外,以RNP复合物的形式传递可以避免病毒传递可能产生的免疫反应。”

其他优势包括基因编辑系统的体内外传递、无病毒传递、具有成本效益的治疗配方、一致性、GMP兼容性,以及未经修饰的蛋白的传递。

NTrans的概念验证数据表明,iTOP可能在体内、眼内应用CRISPR基因编辑技术。de Boer说他们正专注于角膜和视网膜的应用。

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NTrans正在开发一种新的专利CRISPR核酸内切酶,用于iTOP。该组合将为免疫治疗和基因组应用创造一个新的GMP兼容平台。de Boer宣称:“我们正朝着首次人体应用迈出下一步,特别关注在角膜和视网膜的应用。”最终,他计划将这些技术应用于个性化的基因编辑疗法,以治疗癌症和遗传疾病。

4、克服异种移植的PERV

由于猪内源性逆转录病毒(PERV)在器官移植过程中有传播给患者的风险,猪异种移植研究在20世纪90年代停止。

为了帮助这一领域的复兴,基因组学先驱George Church博士和研究员Luhan Yang博士共同创立了eGenesis公司,该公司致力于开发与人类相容的器官、组织和细胞。eGenesis正在努力使猪组织无PERV,并尽可能贴近人类组织,以实现挽救生命的医疗干预。

eGenesis总裁兼首席执行官Paul Sekhri介绍到,eGenesis的开发项目有四个关键领域:分别为评估PERV和免疫学的细胞基因组工程、器官生产、临床前测试和促进临床开发的研究。

“我们正在创造三种猪的模型,”Sekhri说。“第一个是无perv的。第二种包括基因改造,以增强与人类免疫系统的兼容性。第三种混合了两种模型。到目前为止,eGenesis已经产生了无perv和免疫模型。”

“每个器官都会携带基因改造,”eGenesis首席科学官杨璐菡补充说,这样就可以将多个组织运送给病人。eGenesis目前正在对基因工程器官进行有效性和安全性测试。“我们不能透露细节,但有非常令人兴奋的早期数据,”她说。

为了开发转基因克隆,“我们首先对单个细胞进行修饰,分离它们,并筛选携带修饰的细胞,这样我们就可以在克隆动物之前选择最完美的细胞,”杨继续说道。

“我们对单细胞修饰的关注使我们与众不同。”这种方法最大限度地减少了意想不到的后果。她说,由于科学团队可以在数年内观察这些动物,“我们可以检查这些猪的病理生理学,以了解这些改变的任何长期影响。”

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该公司正与FDA密切合作,探索该技术,其后果,以及监管考虑。Sekhri预计将于2022年开始临床试验。

5、利用基于植物的基因组编辑工具

Plantedit恰如其名,使用基因组编辑工具开发用于工业和生物制药用途的植物。该公司的第一款产品是非转基因高油酸大豆,已经成功实现商业化。

该公司计划采用相同的技术从植物中开发纯哺乳动物蛋白质和人类药物。目标是使用基于植物的基因组编辑工具显着提高蛋白质或药物产量,从而降低价格。

Plantedit使用由Toolgen开发的CRISPR / Cas9 RNPs来生产非转基因、可持续面向消费者的基因组编辑植物产品。

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▲在该图像中,通过荧光显微镜评估转染期间基因组编辑工具的直接递送,荧光显微镜显示携带元件在拟南芥叶中的位置。

Plantedit使用由其主要合作伙伴Toolgen开发的工具CRISPR /Cas9RNPs®来实现植物转化。目前,该公司正在研究几个植物模型,调节选定的基因以提高动物蛋白质或人类药物的产量和质量。

最初的工作重点是农作物,包括大豆,土豆,葡萄藤和草莓,其他商业相关作物将很快加入。

“我们的重点是开发能够抵御气候变化,病原体感染,生物或非生物胁迫以及除草剂同时产量高的作物,但是尚未选定最佳的植物模型。”Plantedit首席执行官Chidananda N. Kanchiswamy博士说,“我们希望将所有这些具有重要经济意义的特性纳入针对地理区域的新型种质资源中,并直接将基因组编辑工具传递到植物细胞中,而不引入外来遗传物质。”

这样做需要在不使用农杆菌或质粒载体的情况下提供基因组编辑工具。

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Plantedit将如何实现这一壮举是一个商业秘密,但Kanchiswamy表示,他的团队可以“无需移除细胞壁和经历再生障碍”来提供工具。使用非转基因植物的好处可能是巨大的。此类植物不受适用于转基因作物的法规的约束。因此,非转基因植物对全球市场更为可接受。



参考资料:

https://www.genengnews.com/insights/gene-editing-startups-fabricate-industrial-grade-crispr-tools/

https://36kr.com/p/5067752



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