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2019-05-06

Nature:杜克大学用一种看似简单的修饰,将CRISPR准确性提高了50倍!

CRISPR可能是当今最重要的基因编辑产物,它有望颠覆自然基因组、消除遗传疾病。但是“准确性”一直都是我们面临的阻碍。

早在2017年,一份使用CRISPR的被告就引起了争议。在该实验的老鼠身上发现了大量脱靶基因现象,导致相关酶肆意剪切与疾病不相关的基因。尽管这项研究遭到了激烈的驳斥,并最终被撤回,但人们对这种强大工具的脱靶突变仍深感担忧。

即使是基于CRISPR的编辑器(可以有选择性、相对准确地剪切基因序列),最近也受到抨击,因为它在DNA和RNA中引起了数百个不定向突变。

如果不能确保高水平的准确性,提出的任何CRISPR基因治疗都将成为一场基因骗局。

现在,杜克大学的一个团队可能已经发现了一个通用的解决方案,可以从根本上提高各种 CRISPR的准确性。本月发表在《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上的这项研究,对指导RNA的结构进行了修饰。指导RNA是CRISPR中不可或缺的靶向“侦查猎犬”,它能在Cas酶剪切前捕捉特定的DNA序列。

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这种修饰看似非常简单:将一个“锁定”结构标记到指导RNA的一端,这样只有目标DNA才能被Cas酶所剪切。正是因为这个修饰非常简单,指导RNA 2.0才可以从根本上将多个CRISPR系统的准确性提高将近200倍——不仅可以改进那些依赖于经典Cas9的系统,还包括利用Cas12a和其他剪切酶的较新的诊断系统。

这一方案与以往提高CRISPR准确性的方法截然不同。以往的方法属于增量调整,通常包括寻找新的、更好的Cas剪刀酶。

“我们关注的是一种新的解决方案,它不需要去寻找新的分子,并且适用于任何一种CRISPR系统。”研究报告的作者Dewran Kocak说。

首席作者Charles Gersbach博士补充说道:“这是一个能有效消除脱靶效应的解决方案。”

1、Hello,我是指导RNA!

为什么改变“侦探猎犬”指导RNA的分子结构可以从根本上提高CRISPR的准确性?

历史已经见证了RNA结构的重要性:例如,获得诺贝尔奖的基因沉默技术RNAi花了数十年时间才揭示,对靶向RNA的微小调整可以大大降低免疫反应,或提高效率和准确性。

RNAi的发现来之不易,而从中汲取的经验教训可以用来指导改进基因编辑。我们通常这样描述CRISPR过程:指导RNA——一个看起来像正在蠕动的蠕虫分子——包含一个与目标DNA相匹配的碱基序列。

指导RNA和目标DNA结合时,需遵循严格的碱基配对原则(A与T*,C与G),而后指导RNA将Cas酶拖动到该靶点,使之在特定的位置干净利落地剪切目标DNA分子。(*更准确地说,是“T”在DNA中,“U”在RNA中。同样的碱基,不同的名字。)

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然而,在生物学中,理论常常与现实不符。事实上,指导RNA看起来就像多片三叶草叶子串在一起,里面都是被称为“茎环”的凸起。这使得它的结构稳定,结合效率最大化。

总的来说,人体中含有将近60亿个DNA碱基,而大多数指导RNA只包含20个左右的碱基,这就使得指导RNA和目标DNA错配的几率相当高。

由此可见,设计指导RNA既是一门科学也是一门艺术。与尤达的著名格言“做或不做,没有尝试”不同,科学家们必须经常反复修改特定的指导RNA序列,以使其正常工作。

不过,CRISPR始终有一个设计原型来作为修饰指导RNA分子结构的参照。杜克大学团队所要做的就是根据这样一个原型来设计出合适的指导RNA分子的结构。

2、一切都始于能量

杜克大学团队在细胞能量学中受到了启发。

像任何其他生物反应一样,指导RNA与DNA的结合以及Cas的释放都需要能量。之前的研究发现,指导RNA与DNA匹配的越精确,两个人就越容易形成所谓的“R环”:一种启动整个剪切过程的分子杂交体。

该团队的绝妙想法是在指导RNA的尾部添加一个额外的三叶草状结构。这种“发夹结构”在很多情况下就像一个物理障碍:除非RNA与目标DNA匹配,否则它庞大的结构就会阻止RNA与DNA配对形成R-环。不形成R环,酶就不会切割,这样就能保证靶外DNA序列的完整和安全。

如果序列匹配,指导RNA在与相应DNA配对形成R-环时,就会打开发夹,反过来刺激Cas酶进行剪切。

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该团队在利用计算机模拟实验时,设计了一系列的发夹结构指导RNA(或可以称之为“hp-sgRNAs”),在人类细胞中进行试验。

当与经典的Cas9配对时,新的指导RNA分子的目标特异性增加了约50倍。在一项观察细胞基因组中脱靶效应的敏感实验中,研究小组发现,与经典的指导RNA相比,他们的新型分子消除了124个脱靶位点,并且没有产生任何新的脱靶位点。

许多酶系在结构和功能上与Cas9仅有微弱的相似之处,而新型分子与这些非经典酶结合也可以产生惊人的效果。当与新的发夹结构RNA结合时,Cas12及其变体能够切割指定的DNA序列,其效率与正常导向RNA类似,但脱靶率大大降低。

此外,研究小组还发现,他们能够通过改变“发夹”的细微结构来微调Cas酶的强度。一个“更紧”的发夹结构使二者结合更牢固,这降低了编辑效率,但也大大提高了准确性。“松散”的发夹有助于保持Cas的活性,但准确性没有那么高。

研究人员解释说:“通过观察R-环的形成,我们能够预测发夹结构指导RNA的效果。”这种可预测性是宝贵的——它使未来的科学家更容易仔细校准发夹结构指导RNA和CRISPR系统的强度和准确性。

3、创新性修饰

这并不是科学家们第一次尝试提高CRISPR的准确性。

之前的一个想法是使CRISPR系统成为一个三角关系:一个指导RNA加上两个Cas酶。要进行DNA切割,两个Cas必须结合到相同的DNA序列。这是一个很聪明的方法,但是它需要科学家增加细胞中的物质,使本就很敏感的机体变得更加复杂。

另一个想法是降低Cas酶的活性,使他们不太可能脱靶。但是这种方法也有它的缺点。修饰蛋白质使其具有一定的特性是极其耗时费力的,科学家必须根据他们的需要“定制”每个Cas变体。

Gersbach解释说:“每次我们发现一种新的CRISPR蛋白,都要进行大规模的再次加工,使其更加精确,这并不是一个简单的事情。”

相比之下,杜克大学研究小组对指导RNA的发现,可能会从根本上改变未来CRISPR系统的设计。

Kocak说:“所有CRISPR系统都有指导RNA,这些小RNA更容易修饰。”

接下来,研究小组想进一步确认他们所改进的发夹结构指导RNA可以与其他有活性的Cas酶协同工作。他们还想深入研究这种合作关系是如何运作的,并尝试找到进一步提高靶向性的方法——这种研究不仅是在离体细胞中,更重要的是,要应用于有遗传疾病的动物模型中。



原文链接:

https://singularityhub.com/2019/04/27/a-deceptively-simple-tweak-to-crispr-makes-it-50-times-more-accurate/#sm.0000xpc99g1bagco8v50ssobzok1n


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