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2019-04-29

基因编辑简史

基因编辑(Gene editing)是指特异性改变基因序列,利用酶,特别是核酸酶来对DNA链(DNA strand)进行剪切,移除已有的DNA,或者插入代替的DNA。基因编辑是近几年的大热话题,本文就将回顾一下基因编辑的发展历史。


1

大事年表


1973年:第一个基因工程生物--添加一个基因后可以抵抗抗生素的细菌。

1974年:美国国家科学院(The National Academy of Sciences)暂停基因工程实验直到可以检查安全问题。

1975年:生物学家建立风险评估原则,尽量减低(mitigation)风险,强调公众参与和透明度。

1982年:FDA通过第一个基因工程人类药合成胰岛素(synthetic insulin)。

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1994年:Calgene推出第一个基因工程食物Flavr Savr番茄,它在成熟时可以不掉下来(stay firm when ripe)。

1996年:孟山都公司(Monsanto)推出第一批基因修饰农作物,很快这些基因修饰食品占据市场。

2003年:遗传学家Austin Burt第一个提出“自私基因” (selfish gene)--一个保证大多数后代遗传的基因,可以用作对另一个物种的生物防治。但这个想法在当时还是理论性的。

2012年:University of California–Berkeley和 Broad Institute 的研究人员发现,一种细菌免疫系统CRISPR可以作为基因编辑工具,在生物体的基因组中的任何地方对DNA进行特定的改变。

2014年:Kevin Esvelt等人发表一篇论文,展示如何利用CRISPR进行遗传修饰,永久改变或根除它们。

2015年:第一只基因驱动实验室果蝇,第一只基因驱动蚊子。

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2016年:基因驱动在农业、疾病减少和保护方面具有巨大潜力,但在此类生物体释放到环境中之前,建议进行更多研究。超过150个团体呼吁暂停基因驱动研究,但暂停期在联合国生物多样性公约( United Nations Convention on Biological Diversity)中被取消。

2017年:第一只基因驱动哺乳动物。FDA通过针对癌症的基因改变治疗。


2

基因编辑技术的核心是一个分子工具——2012年发现的CRISPER-Cas9。基因技术的飞速发展,也带来了很多道德社会问题,基因工程是否应该被用于人类疾病的治理或者改变人的外貌智力等性状之类的问题,近几年来一直在被讨论。

修正基因错误的早期尝试

利用基因编辑来治疗疾病或改变性状这个想法,可以追溯到20世纪50年代DNA双螺旋的发现。20世界中期,研究者发现,DNA的碱基序列可以从父母传给子代,一些微小的序列就会对健康产生影响。

认识到这点后,人们就猜测识别导致遗传性疾病的“分子错误”可以成为解决这些错误的手段,从而能够预防或逆转疾病。这一概念是基因理论的基本理念。

但基因技术的发展充满了困难。早期并不是集中在修正基因错误,而是尝试把突变基因功能性拷贝带来的结果最小化,插入基因组或者维持作为染色体外单元。尽管这个方法在一些情况下是有效的,但是很复杂而且有局限性。

为了完全修正基因错误,研究者需要使一个DNA双链在目标位置断裂,一旦断裂后,缺口处能够被细胞通过模板(template)高效地修复,直接将“坏”的序列用“好”的序列代替。但是准确地在目标位置制造断裂,而不涉及其他地方这一点并不容易。

在目标位置断开DNA链

在发现CRISPER-Cas9提出之前,我们有两种使双链位置特异性断裂的方法,一种是利用锌指核酸酶(ZFNs),另一种是利用类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)

ZFNs是一种人工改造的核酸内切酶,由一个一系列 Cys2-His2锌指蛋白串联组成的DNA 识别域和一个由FokI羧基端96个氨基酸残基组成的非特异性核酸内切酶构成。ZFN 要切割靶位点必须以二聚体绑到靶位点上。

因此两个ZFN分别用锌指结构识别5′到3′方向和3′到5′方向的DNA链,当两个ZFN分别结合到位于DNA的两条链上间隔5至7个碱基的靶序列后,可形成二聚体,进而激活FokI核酸内切酶的剪切结构域,使DNA在特定位点产生双链断裂。

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虽然ZFN的出现大大促进了基因组靶向修饰技术, 但是, 由于锌指基序(motif)同其靶序列的对应性并不特异,对于每一个特定的靶点,往往需要构建庞大的锌指表达文库,通过实验筛选出高效且特异结合靶序列的锌指蛋白;而且在基因组上找到合适的ZFN靶点也比较困难。

而TALE在识别靶点的特异性方面和设计方面都比ZFN更有优势。TALENs是由特异性DNA结合结构域 TALE和DNA切割结构域Fok I核酸内切酶组成。TALE蛋白家族来自植物病原体——黄单胞杆菌(Xanthomonas spp.)。TALE与DNA序列特异性结合后,二聚体Fok1核酸酶定点剪切,导致DNA双链断裂

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CRISPR-Cas9 技术利用RNA-DNA结合,而非蛋白质-DNA结合来指导核酸酶活性,简化了设计,使应用范围更广泛。

CRISPR是clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats的缩写,意为成簇的规律间隔的短回文重复序列,广泛存在于细菌和古细菌的基因组中,是一种细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。

当细菌检测到病毒DNA,它会产生出两种较短的RNA, 其中一段RNA包含与入侵病毒相对应的片段。这两种RNA与蛋白质组合成一个复合体,即Cas9。

Cas9蛋白其与FokI酶功能相似,但不需要形成二聚体才能发挥作用,可以分别切割DNA两条单链。当相符的片段,即所谓的向导RNA(guide RNA)在病毒体内找到他的目标时,Cas9就会剪切下目标DNA,消灭病毒。

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研究者发现,它不仅可以消灭病毒DNA,只要改变一下向导RNA,与想要的目标符合就行。而DNA-RNA特异性结合只需了解 Watson-Crick碱基配对原则,因此CRISPR-Cas9系统优于使用ZFNs或者TALENs的融合蛋白设计。

2015年,张锋及其同事发现了一种更具潜力的CRISPR系统,即CRISPR-Cpf1系统。DNA切割酶Cas9与两条小RNAs形成了一种复合物,两条RNAs均是获得切割活性的必要条件。

Cpf1系统更简单一些,它只需要一条RNA。Cpf1酶也比标准SpCas9要小,使得它更易于传送至细胞和组织内。

Cpf1以一种不同于Cas9的方式切割DNA。当Cas9复合物切割DNA时,它切割的是同一位点的两条链,留下的“平端”(blunt ends)在重新连接时往往会发生突变。

采用Cpf1复合物生成的两条链切口是偏移的,在裸露端留下了短悬端(overhang)。这将有助于精确插入,使得研究人员能够更有效及精确地整合一段DNA。


3

CRISPR算是当今生命科学领域最火热的基因编辑技术,接下来我们简单介绍CRISPR的历史以及推动这一领域向前发展的科学家们。

发现CRISPR及其功能

1993-2005, Francisco Mojica

Francisco Mojica是1993年报道的第一个描述现在被称为CRISPR基因座的研究人员。他在整个20世纪90年代都在研究它们,并且在2000年,他认识到被报道的不同重复序列实际上共享了一组共同的特征,现在我们知道这是CRISPR序列的标志(他与Ruud Jansen共同创造了该名词 CRISPR,Jansen在2002年首次使用该术语)。

2005年,他报告说这些序列与噬菌体基因组的片段相匹配,基于这一发现他提出CRISPR是一种适应性免疫系统的假说,后来被证明这个假说是正确的。另一个小组在同一时间发表了类似的研究结果。

发现Cas9和PAM

2005.03, Alexander Bolotin

Alexander Bolotin在研究刚刚测序的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)时,发现了一个不寻常的CRISPR基因座。尽管CRISPR阵列与先前报道的系统相似,但它缺少一些已知的cas基因,而是包含新的cas基因,包括编码大分子蛋白质的基因,他们预测该蛋白具有核酸酶活性,就是现在的Cas9。

此外,他们指出,与病毒基因具有同源性的间隔区在一端都具有共同的序列。该序列是原型间隔物相邻基序(PAM),是目标识别所必需的。

适应性免疫的假设方案

2006.03, Eugene Koonin

Koonin通过计算分析研究了直系同源蛋白质簇,基于天然间隔区阵列中与噬菌体DNA同源的插入物,提出了细菌免疫系统CRISPR级联的假设方案,放弃了先前Cas蛋白可能包含新的DNA修复系统的假设。

适应性免疫的实验证明

2007.03, Philippe Horvath

Horvath及其同事通过实验证明,CRISPR系统确实是一种适应性免疫系统:它们将新的噬菌体DNA整合到CRISPR阵列中,这使它们能够对抗下一波噬菌体的攻击。此外,他们表明Cas9可能是干扰所需的唯一蛋白质,但CRISPR系统灭活入侵噬菌体的过程的细节尚不清楚。

间隔序列被转录成指导RNA

2008.03, John van der Oost

科学家们很快开始研究CRISPR-Cas9系统具体是怎样干扰入侵的噬菌体的。John van der Oost及其同事发现在大肠杆菌(Escherichia coli)中,来自噬菌体的间隔序列被转录成小RNA,称为CRISPR RNA(crRNA),引导Cas蛋白到达目标DNA。

发现CRISPR作用于目标DNA

2008.10, Luciano Marraffini and Erik Sontheimer

Luciano Marraffini and Erik Sontheimer发现CRISPR系统的靶向分子是DNA,而不是RNA。这有点令人惊讶,因为许多人认为CRISPR与真核RNAi沉默机制平行,后者靶向RNA。

Marraffini和Sontheimer在他们的论文中明确指出,如果将该系统转移到非细菌系统,该系统可能是一个强大的工具。(然而,应该注意,不同类型的CRISPR系统可以靶向RNA。)

发现Cas9剪切目标DNA

2010.12 Sylvain Moineau

Moineau及其同事证明,CRISPR-Cas9在PAM上游3个核苷酸的位置,对靶DNA产生精确的双链断裂。他们还证实Cas9是CRISPR-Cas9系统中切割所需的唯一蛋白质。这是II型CRISPR系统的一个显着特征,由单个大蛋白(此处为Cas9)与crRNAs共同介导干扰。

发现cas9系统中的tracrRNA

2011.03 Emmanuelle Charpentier

Emmanuelle Charpentier团队对酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)进行了小RNA测序,其具有含Cas9的CRISPR-Cas系统。他们发现,除crRNA外,还存在第二种小RNA,称为反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。他们发现tracrRNA与crRNA形成双链体,正是这种双链体将Cas9引导至其靶标。

CRISPR系统可以在其他物种中异源地起作用

2011.07, Virginijus Siksnys

Siksnys及其同事克隆了来自嗜热链球菌(一种II型系统)的整个CRISPR-Cas基因座,并在大肠杆菌(不含II型系统)中表达,发现它能够提供质粒抗性。这表明CRISPR系统是独立的单元并且证实了II型系统的所有必需组件都已知了。

Cas9介导的切割的生化表征

2012.09, Virginijus Siksnys

利用其异源系统,Siksnys和他的团队将来自大肠杆菌菌株的crRNA复合物Cas9纯化,该菌株经过工程改造以携带嗜热链球菌CRISPR基因座并进行一系列生化实验表征Cas9的作用模式。

他们验证了切割位点和PAM的需求,并使用点突变,他们发现RuvC结构域切割非互补链,而HNH结构域切割互补位点。

他们还指出,crRNA可以减少到20-nt的伸展,足以有效切割。他们表明可以通过改变crRNA的序列来重新编程Cas9以定位他们选择的位点。

2012.06, Charpentier and Jennifer Doudna

与Gasiunas等人的研究结果相似。几乎同时由Emmanuelle Charpentier与加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna合作报道。 Charpentier和Doudna还报告说,crRNA和tracrRNA可以融合在一起,形成一个单一的合成导向RNA,进一步简化了系统。

利用CRISPR Cas9进行基因编辑

2013.01, Feng Zhang

之前曾参与其他基因组编辑系统如TALENs的Zhang首先成功地将CRISPR-Cas9用于真核细胞的基因组编辑。Zhang和他的团队设计了两种不同的Cas9直向同源物(来自嗜热链球菌和化脓性链球菌)并证明了人和小鼠细胞中的靶向基因组切割。

他们还表明系统(i)可以编程为靶向多个基因组位点,(ii)可以驱动同源定向修复。来自哈佛大学George Church实验室的研究人员在同一期“Science”杂志上报告了类似的研究结果。


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